一、实验室霉菌检测中常见的问题

　　霉菌：

　　不是分类学上的名词，而是一些丝状真菌的通称，属真菌的一部分；其对人类具有双重性，有利的方面是它可以用来酿造、工业发酵、抗生素和酶制剂的生产等，不利方面是它能引起农副产品、食品、原料及器材的腐烂，也感染并引起人类和动、植物的多种疾病，少数种类，如黄曲霉，能产生黄曲霉毒素，黄曲霉毒素是一种致癌物质，危害人、畜的健康和生命。因此，霉菌的检测对于食品的安全性很重要。

　　食品中常见的霉菌：毛霉属、根霉属、曲霉属、青霉属等。

　　检测中的注意事项：

　　1、取样的代表性。

　　2、取样工具的无菌。

　　空气中霉菌的孢子含量很高，所以，取样的工具、容器等要经过严格的高压灭菌。

　　3、检样的方法。

　　（1）由于霉菌易被携带，所以，检样时操作人员应尽量避免自身携带的可能。

　　（2）样品的均质及充分振摇。因为有些孢子是连成串的，故均质和振摇能使其充分散开，同时，在各梯度连续稀释时，也要用灭菌吸管反复吹吸几次，使孢子充分散开。

　　4、培养温度和时间。

　　培养温度25-28℃培养，3天后观察，需培养观察一周。

　　霉菌检验中常用的培养基：孟加拉红琼脂、马铃薯葡萄糖琼脂、察氏琼脂、高盐察氏琼脂等。

　　5、检样中常见的问题。

　　（1）不同稀释度计数结果相同；

　　（2）不生长或生长很好连成片无法计数；

　　原因：

　　①稀释时未经反复振摇，吹吸，导致孢子未充分散开，影响了计数的结果。

　　②由于培养基不适宜，pH值低等，致使生长较慢。

　　③观察时间的掌握。真菌生长较慢，故需5d后才能观察出结果。每天都要观察结果。

　　二、微生物操作中常见问题分析

　　1、划不出单个菌落的原因：

　　（1）平板上有过多的水分；

　　（2）划线时接种环未经反复灼烧；

　　（3）多区划线，三区或四区划线。

　　2、涂布和倾注的区别：

　　涂布利于观察，但由于涂布棒上会带有少量的菌液，可能影响计数的准确性；倾注更为准确，但不利于观察菌落的状态。

　　Beuchat和Matsuda等人分别对这两种方法作了大量比较试验后发现，对霉菌计数来说，涂抹法有以下几方面优越于倾注法：

　　①培养出的霉菌菌落数较多；

　　②培养所需的时间较短；

　　③霉菌孢子、菌落形态特征发育完全，便于鉴定。

　　这是因为绝大多数霉菌是好氧的，在培养基表面生长快，发育好，而混在培养基中发育就会受影响，而且在培养基倾注时霉菌孢子易受热损伤。

　　3、培养基地选择：

　　培养基的选择应根据实验材料和检验目的来确定。目前国标方法中使用的培养基有：马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)、孟加拉培养基(RBC)、高盐察氏培养基(CAO)，其中PDA和RBC适合于一般的霉菌和酵母菌生长，而CAO则适合于高渗性霉菌生长，酵母菌几乎不长。

　　在日常检测中我们发现，有些常见的耐高渗性霉菌，如局限曲霉、谢瓦曲霉、赤曲霉、Wallemia等在PDA、RBC上生长非常缓慢或不长，而这些菌在高渗培养基如M40Y、DG18(M40Y琼脂配方：蔗糖400g，麦芽提取汁20g，酵母提取汁5g，琼脂20g，氯霉素50mg，蒸馏水1000mL；DG18琼脂配方：葡萄糖10g，蛋白胨5g，KH2PO41g，MgSO4·7H2O 0.5g，氯霉素0.1g，0.2%二氯硝基苯胺1.0mL，琼脂15g，蒸馏水1000mL，pH6.5)上则正常生长。孢子、形态特征发育良好，而且酵母菌也能在M40Y、DG18上生长，因此，若能同时采用PDA和M40Y(或DG18)分离培养各类样品中的霉菌，将能更全面地反映出污染霉菌的菌相。特别是对干燥食品、高糖食品、淹渍食品等，更有必要同时采用M40Y或DG18。

　　由于霉菌中很多种类不会产生有毒的霉菌毒素，危害较小，而有的菌株即使污染数量不多，但其产生的霉菌毒素却危害较大，因此仅作霉菌计数并不能全面反映其危害程度，重要的是要知道污染菌的菌相，才能更好地判断被污染食品的安全程度。

　　为此，国外有些研究者设计出各类选择性培养基，可以识别产毒的霉菌。如AFPA培养基(配方：酵母提取汁20g，蛋白胨10g，柠檬酸铁铵0.5g，0.2%二氯硝基苯胺1.0mL，琼脂15g，蒸馏水1000mL，pH5.6)用于分离黄曲霉毒素产生菌高污染率的食品。产黄曲霉毒素的菌株黄曲霉和寄生曲霉在AFPA上30℃培养2~3天就形成背面有亮橙黄色的特征性菌落，非常容易识别。有人利用该培养基分离黄曲霉高污染食品花生、玉米等,取得了满意的结果。因此,针对不同样品,有目的地设计出相应的选择性培养基,以筛选污染菌中的危险菌群,将是一个值得探索的方向。

　　4、 培养基配制时应注意的问题：

　　(1)灭菌温度要严格控制，按照要求灭菌，尤其含糖量较高的培养基温度不应太高，过高会导致糖分焦化，影响质量；

　　(2)琼脂培养基不能反复溶化，反复溶化会破坏培养基中的营养成分；

　　(3)培养基不能反复灭菌，反复灭菌也会导致营养成分的破坏；

　　(4)含琼脂的培养基灭菌后，要摇匀。

　　5、 平板的保存：

　　大多数平板如 VRBA、DC、尿素酶生化管、显色系列等要避光低温保存。

　　6、 产品的保存：

　　(1) 干粉培养基：避光干燥，结块后不能使用。

　　(2) 亚碲酸钾卵黄增菌液、50%卵黄乳液等：冷冻保存，使用时，要常温解冻，避免水浴加热。

　　(3) 抗生素类：冷藏保存，温度过高会导致灵敏度下降。

　　(4) 兔血浆：冷藏保存少量的红色不会影响结果。

　　7、添加剂的添加：

　　（1）温度的掌握。卵黄和抗生素类添加的温度都不应太高。

　　（2）定量。过多会抑制一些目标菌，太少又会导致杂菌的过度生长。

　　8、培养温度的掌握：

　　（1）真菌类，25-28℃培养。

　　（2）细菌类，李氏菌在增菌和生化中要求培养温度在30℃左右。

　　（3）其他，一般在36℃左右。

　　9、接种方法：

　　常用的方法主要有划线、三点接种、穿刺接种、倾注接种、涂布接种、液体接种。

　　10、革兰氏染色方法：

　　染色时间的掌握、冲洗的方法。

　　11、生化实验：

　　（1）接种的方法

　　（2）氧化型和发酵型实验操作

　　（3）阳性菌种的对照

　　（4）接种前的纯化。挑取单个菌落进行一系列的生化。

　　12、最适计数范围

　　霉菌菌落由孢子和菌丝组成，相当扩散，在直径9cm的平皿里，菌落数稍多就相互交叉重叠，影响计数，但数量太少又会产生较大的误差，因此选择适当的稀释度计数是保证结果准确的关键环节之一。

　　我们对这方面作了一些观察研究，首先是将实验菌株的斜面培养物制成含有约106个/mL的孢子悬液，并用血球计数器在显微镜下准确计数，然后将孢子悬液作10-1~10-6倍稀释，吸取不同稀释度的稀释液接种于PDA，25℃培养5天后计数。30种常见霉菌的两种不同计数方法所得结果比较显示，大部分菌株每平板含有10~50个菌落的稀释度时的计数与显微镜计数结果最接近；有近一半的菌株，每个平板含50~100个菌落已较难计数，而大部分菌株，超过100个/平皿或小于10个/平皿的计数结果就与显微计数结果存在较大差别，因此，应尽量选择10~50个/平皿的稀释度进行霉菌计数。

　　而对上述提及的菌丝很丰富、菌落特别扩散的毛霉、根霉、犁头霉等菌株，则应在更少的范围内计数(30个/平皿以内)。为控制霉菌的生长速度和菌落的生长范围，可在培养基中添加少量抗生素，如氯霉素(50~100mg/L)，金霉素(20~100mg/L)，庆大霉素(50mg/L)，土霉素(100mg/L)等。

　　13、关于杀菌的几个概念：

　　（1）抑制：是在亚抑制剂量因子作用下导致微生物生长停止，但在移去这些因子后生长仍可以恢复的生物学现象。

　　（2）死亡：在致死剂量因子的作用下或在亚致死剂量因子长时间的作用下，导致微生物生长能力不可逆丧失，即使移去这种因子后生长仍不能恢复的生物学现象。

　　（3）防腐：在某些化学物质或物理因子作用下，能防止或抑制微生物生长的一种措施，它能防止食物腐败或防止食物霉变。

　　（4）消毒：利用某种方法杀死或灭活物质或物体中所有病原微生物的一种措施，它可以起到防止感染和传播的作用。

　　（5）灭菌：利用某种方法杀死物体中包括芽孢在内的所有病原微生物的一种措施。

　　（6）化疗：利用具有选择毒性的化学物质，例磺胺、抗生素等对生物体内部被微生物感染的组织或病变细胞进行治疗，以杀死组织内的病原微生物或病变细胞，但对有机体无毒害作用的治疗措施。

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